روشهاي جداسازي و تشخيص باكتريهاي بيماريزا در مواد غذايي

اهداف

1- آشنايي با اهميت بيماريهاي ناشي از مواد غذايي .

2- تفكيك و تمايز باكتريهاي عامل مسمويت غذايي و باكتريهاي عامل عفونت غذايي از يكديگر .

3- مقايسه كلي روشهاي سنتي و روشهاي جديد تشخيص و جداسازي باكتريهاي بيماريزا در مواد غذايي .

4- شناخت مراحل مختلف جداسازي و تشخيص باكتريهاي مواد غذايي در روشهاي سنتي ( مراحل پيش غني سازي – غني سازي انتخابي – محيط جامد انتخابي ) .

5- شناخت نسبي روشهاي جديد تشخيص و جداسازي باكتريهاي بيماري زا مواد غذايي ( روشهاي فيزيكي ، شيميايي ، ايمونولوژيكي ، ژنتيكي ).

6- آشنايي با اصلاحات متداول در زمينه جداسازي و تشخيص باكتريها نظير ( غني سازي باكتريها ، محيطهاي مورد استفاده ، اندازه گيري ايمپدانس ، فلوسيتومتري ، هيبريداسيون ELISA,DNA ، كواگلوتيناسيون لاتكس ، PCR و … )
خلاصه

در طول سالهاي گذشته ، بيماري هاي ميكروبي ناشي از مواد غذايي، همواره يكي از عمده ترين بيماري هاي كشورهاي مختلف جهان محسوب گرديده است .

اين بيماريها كه جزء بيماري هاي روده اي تقسيم بندي مي گردند ، نه تنها در كشورهاي در حال توسعه بلكه در كشورهاي توسعه يافته با استاندارد بالاي بهداشتي نيز رو به افزايش بوده اند . به عنوان مثال در ايالات متحده آمريكا از نطر اهميت بعد از بيماريهاي ريوي ، در مقام دوم قرار دارند .

در بين عوامل ميكروبي ، باكتري هاي عام مسمويت مواد غذايي ( Food Bone Bacterial Intoxications )مطرح هستند كه با توليد سم در ماده غذايي باعث بروز مسمويت مي گردند . و گروه دوم تحت عنوان باكتريهاي عامل عفونت مواد غذايي ( Food Borne Bacterial Infections ) مطرح بوده كه با تكثير خود و يا توليد متابوليت هاي خاص باعث بروز عفونت مي گردند . با توجه به اينكه اكثر موارد عفونتها و مسمويتهاي ميكروبي توسط باكتريها انجام مي گيرد ، تشخيص و جداسازي آنها حائز اهميت فراواني است .

امروزه علاوه بر روشهاي سنتي ، تكنيك هاي جديدي براي جداسازي و تشخيص باكتريهاي بيماريزا در موارد غذايي مورد استفاده قرار مي گيرند كه از آن جمله مي توان به روشهاي ژنتيكي ( مثل تكنيك PCR ) ( Ploymerase Chain Reaction ) ، روشهاي فيزيكي ( مثل اندازه گيري مقاومت الكتريكي و روش فلوسيتومتري ( Flow Cyomrtry ) ، روشهاي شيميايي ( مثل هيبريداسيون DNA ( DNA Probe ) و روشهاي ايمونولوژيكي ( مثل كواگلوتيناسيون لاتكس ( Latex Coagglutination ) و تكنيك ELISA ( Enzyme Linked Immuonadsorbent Assay ) اشاره نمود .
مقدمه

ميكروب شناسي موادغذايي يكي از شاخه هاي علم ميكروبيولوژي است كه كاربرد آن در صنايع غذايي و مراكز تحقيقاتي نيازمند افرادي است كه آموزشهاي لازم را ديده و از تجربه قابل توجهي برخوردار باشند و از سوي ديگر آزمايشگاه مناسبي را در اختيار داشته باشند . در اين راستا روشهاي جداسازي و تشخيص باكتريها بويژه باكتريهاي بيماريزا در مواد غذايي كه به دو روش كلي سنتي و مدرن انجام مي گيرد ، حائز اهميت فراواني است . روشهاي سنتي روشهايي هستند كه غالباً وقت گير بوده و عليرغم كم هزينه بودن همواره براي ميكروبشناسان مشكل ساز هستند و خصوصاً هنگامي كه اعلام سريع نتايج از نظر اقتصادي و پزشكي واجد اهميت است ، اين مشكل بيشتر احساس مي گردد . به عنوان مثال در مورد بعضي از ميكروبهاي مهم بيماريزاي موادغذايي ( نظير سالمونلا ) نياز به صرف چندين روز وقت به دليل تهيه محيط هاي متعددي هستيم . خوشبختانه در روشهاي جديد و سريع كه امروزه براي تشخيص و جداسازي باكتريها مورد استفاده قرار مي گيرند ، اين مشكلات مرتفع گرديده و با تكنيكهاي مبتني بر روشهاي فيزيكي ، شيميايي ، ايمونولوژيكي و ژنتيكي ميتوان در اسرع وقت نتايج را اعلام نمود .

روشهاي جداسازي و تشخيص باكتريهاي بيماري زايي در مواد غذايي

الف ) روشهاي سنتي

در روشهاي سنتي عموماً براساس كشت باكتري در محيطهاي مختلف و توليد كلني هاي قابل رويت در يك محيط جامد انتخابي و انجام آزمايشات بيوشيميايي در محيطهاي مايع است . با توجه به اينكه موادغذايي ، ميكروبهاي بيماري زا غالباً به مقدار نسبتاً كمي وجود داشته و توسط ميكروبهاي عامل فساد ، در موضع مغلوب قرار مي گيرند و از سوي ديگر طي عمليات هاي فرآوري مواد غذايي دچار صدمه مي گرداند ، در نتيجه جداسازي باكتري مورد نظر پيچيده تر بوده و زمان بيشتري را طلب مي كند و به همين دليل جداسازي آنها معمولاً در سه مرحله پيش غني سازي ( Pre Enrichment ) ، غني سازي ( Enrichment ) و كشت در محيط جامد انتخابي ( Selective Plating ) صورت مي گيرد .

1- مرحله غني سازي : اين مرحله كه به آن مرحله احياء ( Resuscitation ) نيز گفته مي شود ، براي حفظ تعداد كم باكتريها و التيام باكتريهاي صدمه ديده در فرآيندهاي مختلف ضروري به نظر مي رسد و در مورد بعضي از ميكروبهاي بيماريزا نظير سالمونلا استفاده از يك پيش غني كننده ( مثل محيط لاكتوز براث Lactose Broth ) الزامي است . براي انجام اين مرحله از يك محيط غير انتخابي استفاده مي گردد

2- مرحله غني سازي : در مواقعي كه تعداد باكتريهاي بيماريزا در نمونه غذايي بسيار كم است ، غني سازي انجام مي گيرد . هدف از اين مرحله رشد ارگانيسم مورد نظر بوده و لذا با استفاده از محيط غني كننده مايع ، باكتريهايي كه بالاترين ضريب رشد GrowthRate را در بين جمعيت ميكروبي آن نمونه غذايي ، دارا باشند در اين محيط رشد خواهند نمود . مثلاً در مورد سالمونلا از محيطهاي سلنيت سيستينSelenit Cistine يا تتراتيوناتTetrationate استفاده مي گردد. اكثر محيطهاي غني سازي از نظر مواد مغذي پيچيده بوده و شرايطي را فراهم مي سازند كه طي آن رشد ميكروارگانيسمهاي رقيب كاهش يابد ويا از رشد آنها جلوگيري شود و تنها باكتري مورد نظر رشد نمايد . لازم به ذكر است در مورد بعضي از باكتريها نظير يرسينا آنتروكوليتيك ( Yersinia Entrocolitica) و ليسريامنوسيتوژنز ( Listeria Moncytogenes) به علت سرما دوست بودن ، غني سازي در سرما صورت مي گيرد .

1- مرحله استفاده از محيطهاي جامد انتخابي

محيطهاي جامد انتخابي ، محيطهايي هستند كه يك ميكروب يا گروه خاصي از ميكروبها را انتخاب مي كنند . اصول ساخت اين محيط ها مشابه محيطهاي غني كننده مايع است و در تهيه آنها از عوامل مورد نياز براي رشد باكتري استفاده مي گردد . بدين معني كه در تهيه آنها از موادي استفاده مي شود كه باعث مي گردد ميكروب مورد نظر در آن رشد كرده و از ساير ميكروبها تفكيك داده مي شود .

البته پيشنهاد مي گردد حتي در مواردي كه پرگنه هاي واضح و تيپيكي در اين محيطها رشد كرده باشد ، بهتر است قبل از نتيجه گيري نهايي ، از آزمايشات تاييدي استفاده گردد . به عنوان مثال آزمايشات بيو شيميايي ساده اي نظير كاتالاز ( Catalase ) ، اكسيداز ( Oxidase ) ، كوآگولاز

( Coagulase ) و همچنين رنگ آميزي گرم مي توانند بسيار مفيد واقع شوند .
ب ) روشهاي جديد

در طي سالهاي اخير ، روشهاي جديدي به منظور جداسازي و تشخيص ميكروبهاي بيماريزا مواد غذايي مطرح گرديده اند كه در مقايسه با روشهاي سنتي ، داراي سرعت بسيار بالاتري در تشخيص عامل بيماري زا هستند . در جدول شماره ((1 )) تعدادي از اين تكنيك ها معرفي گرديده اند .

1- روشهاي فيزيكي :

از روشهاي فيزيكي رايج مي توان به دو روش زير اشاره نمود :

الف ) اندازه گيري مقاومت الكتريكي ( Impedance Measurment )

اين روش ، تكنيك نسبتاً سريعي است كه توسط آن جداسازي باكتري براساس فعاليت متابوليكي و مقاومت الكتريكي كه از خود نشان مي دهد ، صورت مي پذيرد . بدين صورت كه باكتريهاي موجود در نمونه ، با گذشت زمان از خود مقاومت الكتريكي نشان مي دهند كه ميزان آن بر روي منحني خاص نمايش داده مي شود و اندازه گيري مي گردد و از روي منحني حاصله نوع باكتري و تعداد آن را تخمين مي زنند . با استفاده از اين روش جداسازي تعدادي از باكتري هاي بيماريزايي مواد غذايي مانند سالمونلا ، اشرشياكولي ، استفيلوكوكوس آرئوس ( Staphylococcous Aureus ) و ليستريامنوسيتوژنز ، به طور موفق انجام گرديده است .
ب) فلوسيتومتري

منظور از اين روش ، اندازه گيري تعدادي از سلولهاي باكتري در يك محيط سوپانسيون ( مايع ) است كه در آن سلولها بطور جداگانه توسط يك كانال جرياني ( Flow Cytometry Canal ) به طرف دتكتور ( Detector ) هدايت مي شوند و دستگاه قادر است كه هر سلول را از نظر تركيبي و هويتي مشخص نمايد ( براساس بازهاي آلي آدنين ( Adenine ) ، تميمين ( Thymine ) ، گوانين ( Guanine ) و سيتوزين ( Cytosine ) با استفاده از اين روش باكتري ليستريا منوسيتوژنز در شير مورد شناسايي قرار گرفته است.
2- روشهاي شيميايي

الف ) روشهاي سنجش توليد ATP توسط باكتري ( ATP Assessment ) تعيين ميزان ATP توليد شده توسط باكتري يكي از روشهايي است كه در تعيين وضعيت بهداشتي مواد غذايي مورد استفاده قرار مي گيرد و اساس آن واكنشي است كه بين آنزيم لوسيفراز ( Luciferase ) صورت مي گيرد . بدين صورت كه آنزيم در حضور ATP توليد شده توسط باكتريها ، بر روي لوسيفرين اثر كرده و نور توليد مي كند كه ميزان اين نور توليد شده توسط دستگاه اندازه گيري مي گردد . بديهي است هر چه تعداد باكتري در نمونه مورد بررسي بيشتر باشد ، ATP بيشتري توليد گرديد و نور بيشتري ايجاد مي گردد .

ب ) روش هيبريداسيون DNA ( DNA Hybridization ) : اين روش كه به آن DNA Probe نيز اطلاق مي گردد با استفاده از قطعات آماده و شناخته شده DNA ( پروب هاي آماده DNA ) انجام مي گيرد و در واقع بين قطعه DNA معلوم و شناخته شده با قطعه DNA باكتري مجهول و ناشناخته يك نوع هيبريداسيون تكنيك عبارتند از :

1- نمونه مورد نظر را كه حاوي باكتري است ، از يك فيلتر غشايي عبور مي دهند تا باكتري روي اين غشاء عبور مي دهند تا باكتري روي اين غشاء را پر كند .

2- DNA باكتري مورد نظر را جدا كرده و قسمتي از آن را روي فيلتر فيكس مي نمايند . (DNA Probe باكتري ).

3- قطعه اي از DNA كارك داده شده را كه مي دانيم مربوط به چه نوع باكتري است (Probe آماده) به فيلتر اضافه مي كنند تا توسط آن DNA باكتري مورد نظر را شناسايي كنند . بدين صورت كه چنانچه قطعه DNA مارك داده شده با قطعه DNAباكتري مجهول جفت شوند و هيبريد تشكيل دهند، با شستشوي فيلتر از هم جدا نمي شوند و بر روي فيلتر باقي مي مانند و بدين شكل باكتري مورد نظر شناسايي مي گردد . مثلاً اگر پروب آماده اي از باكتري سالمونلا را به فيلتر اضافه كنيم ، چنانچه باكتري مورد بررسي نيز سالمونلا باشد ، قطعات DNA آنها با يكديگر هيبريد تشكيل داده و جفت مي شوند در حال حاضر اين تكنيك به صورت كيت هاي تجاري خاصي جهت تشخيص باكتريهاي سا لمونلا، كمپيلوباكترCampilobacter ژژوني ، و ليستريا مورد استفاده قرار مي گيرد
3-روشهاي ايمونولوژيكي

روشهاي سرولوژيكي از سالها قبل به صورت اختصاصي در مواد غذايي مورد استفاده قرار گرفته اند ليكن به دليل وجود واكنشهاي كثبت كاذب كه در اين واكنشها رخ مي دهد چندان مورد استقبال واقع نگرديدند . در سالهاي اخير با استفاده از تكنيك هايي نظير پادتن هاي مونوكلونال Mono Coaglutination و كوآگلوتيناسيون لاتكسLatex Coaglutination و اليزااين مشكل مرتفع گرديده و امروزه كاربرد بسيارزيادي در تشخيص باكتريهاي بيماريزا دارند
الف) روش كوآگلوتيناسيون لاتكس

روش ساده اي است كه بر اساس آن مبتني بر انجام واكنش بين پادتن و پادگن ( يا آنتي بادي و آنتي ژن ) است كه توسط يك آنتي بادي مشخص شده ، آنتي ژن مورد نظر (باكتري يا توكسين ان) تشخيص داده مي شود . امروزه در بازار ، پادتن هاي آماده كه به لاتكس حساس شده اند Antibody Sensitised Latex به صورت تجارتي وجود دارد كه نمونه آن كيست تجاري سالمونلا(پادتن ها آماده سالمونلا) است كه براي جداسازي سالمونلادر نمونه هاي مواد غذايي مورد استفاده قرار مي گيرد . يعني در اثر واكنش بين پادتن حاوي لاتكس و آنتي ژن (باكتري يا توكسين باكتري ) آگلوتيناسيون ايجاد شده و باكتري تشخيص داده مي شود

ب) روش ELISA

يكي از تكنيك هايي كه به طور وسيع و گسترده اي براي جستجوي ميكروبها در مواد غذايي مورد استفاده قرار مي گيرد ، اليزا ميباشد كه اساس آن اتصال يك آنزيم به آنتي ژن يا بادي مورد نظر است .

مراحل كار عبارتند از: 1- باكتري يا توكسين مورد نظر(آنتي ژن ) روي يك فاز جامد قرار داده مي شود (كه اين فاز جامد معمولاً پلي استيرن Poly Styrene است )

2- آنتي سرم اضافه مي شود.

3-پادتن اختصاصي كه حاوي آنزيم است اضافه مي شود .( آنتي ايمونوگلوبولين )

4-شستشوي ملايم مي دهند و ميزان آنزيم باقيمانده در لوله يا حفره ميكروتيتر Microtiter را اندازه گيري مي كند تا مقدار مصرف آنزيم ، ميزان پادتن هاي اختصاصي سرم اوليه مورد آزمايش قرار مي گيرد .

قابل ذكر است آنزيمي كه به طور معمول در اين تكنيك مورد استفاده قرار مي گيرد ، آنزيم هورس راديش پراكسيداز (Horseradish Peroxidase ) است كه مقدار آن را با اضافه كردن سوبستراي خاص پراكسيداز و به روش كاليمتري ( Colorimeter ) اندازه گيري مي كنند .

نوعي از اين تكنيك به نام ساندويج اليزا موسوم است كه در آن پادتن جذب فاز جامد مي شود و پس از شستشو محلول مورد آزمايش كه حاوي آنتي ژن است اضافه مي شود و مورد نظر حداقل بايد دو موضع اتصال داشته باشد ) امروزه از اين روش براي تشخيص استافيلوكوكوس آرئوس ، سالمونلا ، اشرشياكولي و توكسين هاي آنها استفاده مي گردد .

ج ) روش غني سازي انتخابي حركت ( Selective Motility Enrichment )

اين روش كه از آن براي تشخيص سريع سالمونلا استفاده مي گردد و به آزمايش سريع سالمونلا ( Samonella Rapid Test ) نيز معروف است ، در واقع يك روش سرولوژيكي است كه با غني سازي باكتري توام است . يعني ابتدا بايستي مراحل پيش غني سازي باكتري ، غني سازي انتخابي در محيط مايع و كشت در محيط جامد انتخابي صورت گرفته و سپس آزمايشات سرولوژيكي انجام گيرد . از آنجاييكه در اين تكنينك ، حركت سالمونلا مدنظر است ، تنها سالمونلاهاي متحرك قابل جداسازي و تشخيص هستند و با توجه به اينكه اكثر سالمونلاها و به ويژه سالمونلاهاي بيماريزاي مواد غذايي متحرك هستند ، اين روش سريع كاربرد بسيار زيادي دارد .
4- روشهاي ژنتيكي

در طي سالهاي اخير روشهاي ژنتيكي پيشرفت چشمگيري داشته ان دو به وفور در علوم بيولوژي و ميكرو بيولوژي مورد استفاده قرار مي گيرند . بعضي از اين روشها عبارتند از تكنيك نمايش DNA پلاسميدي ، تكنيك آناليز DNA پلاسميدي ، تكنيك آناليز DNA باكتري توسط آنزيمهاي اندونوكلئاز و تكنيك PCR .

تكنيك PCR ( ‍Polymerase Chaina Reaction ) : يكي از روشهاي دقيق تشخيص باكتريهاست مي باشد كه منظور از آن پليمريزاسيون و تكثير و بزرگ سازي قسمتي از DNA باكتري است كه با كمك پرايمرها ( Primers )صورت مي گيرد .

مراحل كار عبارتند از :

1-قطعه اي از DNA باكتري مورد نظر را كه بايد بزرگ و تكثير شود ، مشخص مي كنند .

2-با كمك حرارت 95 درجه دو رشته DNA را از يگديگر باز كرده و در واقع DNA باكتري را دناتوره مي كنند .

3-با استفاده از دو پرايمر كه به دو طرف اين قطعه DNA متصل مي شود و يك آنزيم مقاوم به حرارت به نام DNA پليمراز ( Thermostable DNA Polymerase ) ، DNA باكتري را پلي مريزه و تكثير مي نمايند . ( اين آنزيم از باكتري گرمادوستي به نام ترموفيلوس آكواتيكوس بدست مي آيد ) اين تكنيك ، روشي سريع ، قدرتمند و بسيار مناسب جهت تشخيص وجود باكتري مي باشد و حتي قادر است تعداد 10 سلول از يك باكتري را در يك نمونه 10 گرمي غذا ، مشخص نمايد و از اين رو يك روش بسيار ارزشمند محسوب مي گردد .
نتيجه گيري

براي تشخيص و جداسازي باكتريها بويژه باكتريهاي بيماريزا مواد غذايي به طور كلي دو نوع روش وجود دارد . روشهاي سنتي كه از ساليان دور مورد استفاده قرار گرفته اند و روشهاي جديد كه غالباً طي دهه اخير مطرح گرديده اند . روشهاي سنتي كه غالباً در سه مرحله پيش غني سازي ، غني سازي و كشت در محيط جامد انتخابي انجام مي گيرند ، حتي در موارديكه در محيط انتخابي پرگنه واضح و تيپيكي توليد شده باشد بهتر است كه بوسيله بعضي از آزمايشات بيوشيميايي مورد تاييد قرار گيرند ( آزمايشات ساده اي مثل كاتالاز ، اكسيداز ، كوآگولاز و رنگ آميزي گرم اگر به درستي انجام گيرند كمك بسيار زيادي به فرد نموه و از اتلاف وقت جلوگيري مي نمايند ) در مجموع روشهاي سنتي اگر چه ارزش زيادي داشته و هزينه كمي را به همراه دارند ليكن جداسازي باكتريها با اين روشها بسيار وقت گير وز مان بر بوده و همواره براي محققين ، مشكلاتي را ايجاد مي نمايند . اين موضوع خصوصاً در مواقعي كه با محدوديت زماني مواجه هستيم و بايستي نتيجه را سريعاً اعلام نماييم اهميت بيشتري پيدا مي كند . روشهاي جديد جداسازي و تشخيص باكتريهاي بيماريزا ، برخلاف روشهاي سنتي ، سرعت بسيار بيشتري دارند كه علي رغم اين برتري نيازمند آزمايشگاههاي مجهز و افراد بسيار مجرب هستند و هزينه هاي بسيار زيادي را به همراه دارند . با توجه به پيشرفتهاي اساسي و قابل توجهي كه در اين روشها صورت پذيرفته است به تدريج مشكلات مربوط به جداسازي و تشخيص باكتريهاي مختلف مرتفع خواهند گرديد . در بين روشهاي جديد ، تكنيك هاي ELISA , PCR و هيبريداسيون DNA داراي كاربرد بيشتري مي باشند .