شناسایی باکتریها در آزمایشگاه تشخیصی در مقایسه با شناسایی تاکسونومیک جداسازی باکتریها از بیماران و شناسایی آنها به دلیل اینکه بیماریهای عفونی ناشی از باکتریهای مختلف، دوره ها و پیامدهای متنوعی دارند به درمان کمک می کند. ارزیابی حساسیت ایزوله ها(یعنی تعیین حداقل غلظت مهرکننده یا (MIC می تواند به انتخاب آنتی بیوتیک مناسب جهت درمان کمک کند. ممکن است شناسایی گونه خاص باکتری (یا سوشها) که بطور غیر معمول جداشده،نشانه این باشد که منشاء شیوع عفونت،تجهیزات بیمارستانی آلوده و یا انجام تکنیکهای ضدعفونی کردن نا مناسب از سوی پرسنل بیمارستان باشد. وقتی بیماران،مشکوک به داشتن یک عفونت باکتریال هستند معمولا” کلونی های قابل مشاهده میکروب موردنظر را از کشت خالص (روی پلیت آگار) جدا می کنند و سپس نوع باکتری تعیین می شود. شناسایی باکتری بر اساس اصول تاکسونومی است که برای وضعیت بالینی به کار می رود.در آزمایشگاه تشخیصی،هر روز باید تعداد زیادی نمونه شناسایی شده و نتایج در اسرع وقت آماده شوند . آزمایشات باید به راحتی آموزش داده شوند،کم هزینه باشند و به آسانی انجام شوند.این روشهای معمول برای تعیین نوع باکتریها بر اساس خصوصیات مورفولوژیک و متابولیک هستند. آزمایشات تشخیصی بر اساس اطلاعات تفکیکی که به طور تجربی فراهم می کنندانتخاب می شوند. تستهای مختلفی برای هرکدام از پاتوژنهای موردنظر وجود دارند. علاوه بر این، امروزه روشهای زیست مولکولی (جهت شناسایی ژنهای خاص یا قطعات ژنی)در آزمایشگاه بالینی رایج هستند. اصول طبقه بندی مدرن،اغلب از روشهای پیچیده تری استفاده می کنند و مرتبط با خصوصیات محتویات ساختمانی باکتریها هستند.این روشها اغلب شامل روشهایی هستند که براساس “زیست مولکولی” و یا “شیمی تحلیلی” هستند. اکنون مشخص شده که بسیاری از طرحهای کلاسیک جهت تفریق دادن باکتریها ،اطلاعات کمی درمورد روابط ژنتیکی آنها می دهند و در مواردی حتی از نظر علمی غلطند. اطلاعات جدید،موجب نامگذاری مجدد گونه های خص باکتریها شده و در مواردی ، روابط کاملا” مشخصی را درون و میان خانواده های مختلف باکتریها مشخص کرده اند.
واژه های تاکسونومیک(طبقه بندی) خانواده: گروهی از جنسهای مرتبط جنس:گروهی از گونه های مرتبط گونه:گروهی از سویه های مرتبط تایپ:مجموعه ای ازسویه های درون یک گونه(مثلا” بایو تایپ،سروتایپ) سویه:یک رده یا ایزوله تک از یک گونه خاص رایجترین واژه مورد استفاده، نام گونه است(مثلا” Streptococcus pyogenes –به اختصار S.pyogenes ).نام گونه همیشه دو قسمت دارد،یکی مشخص کننده جنس مثلا” در مثال گفته شده “”Streptococcus و دیگری مشخص کننده گونه(در این مورد ” “pyogenes ).نام جنس همیشه با حرف بزرگ شروع می شود اما نام گونه اینطور نیست.همیشه در زیر نام جنس و گونه خط کشیده می شود یا هر دو به شکل مورب نوشته می شوند. مراحل جداسازی تشخیصی و شناسایی باکتریها مرحله اول-نمونه های مایعات بدن (مثل خون،ادرار،مایع مغزی نخاعی) به طور خطی روی پلیت کشت داده می شوند و کلونیهای جداشده باکتریها (که با چشم غیر مسلح قابل مشاهده اند) بعد از گرماگذاری به مدت یک تا چند روز ظاهر می شوند.هر کلونی،شامل میلیونها سلول باکتری است.بررسی این کلونیها از نظر اندازه،بافت،رنگ و(در صورت رشد روی بلاد آگار) واکنشهای همولیز به عنوان اولین مرحله شناسایی باکتری بسیار مهم است.نیاز ارگانیسم به اکسیژن جهت رشد نیز،یک خصوصیت افتراقی مهم است. مرحله دوم-رنگ آمیزی گرم کلونیها و مشاهده سلولهای باکتری در زیر میکروسکوپ مرحله سوم-باکتریها بوسیله این کلونیهای ایزوله شده شناسایی می شوند.این کار اغلب نیاز به 24 ساعت زمان اضافی برای رشد دارد.
.
رنگ آمیزی گرم.
محیط مایع تیوگلیکولات.باکتری میله ای شکل ودر صورت رشد در محیط مایع به صورت زنجیره ای.می تواند موجب اندوکاردیت تحت حاد باکتریال و پوسیدگی دندان شود رنگ آمیزی گرم یک کلونی که روی لام خشک شده وطبق روش زیر با موادی مجاور شده است(شکل 2 و 3) : مرحله 1 –رنگ آمیزی با کریستال ویوله مرحله 2 – تثبیت بوسیله ید،موجب ثابت شدن رنگ کریستال ویوله می شود.همه باکتریها بنفش یا آبی باقی می مانند. مرحله 3-خارج کردن رنگ بوسیله الکل یا حلالهای دیگر.بعضی باکتریها رنگ را از دست می دهند (گرم منفی) و بقیه آنرا حفظ می کنند (گرم مثبت). مرحله 4-رنگ آمیزی معکوس با سافرانین.باکتریهای گرم مثبت قبلا” با کریستال ویوله رنگ شده اند و بنفش باقی می مانند.باکترهای گرم منفی صورتی می شوند. در زیر میکروسکوپ،ظاهر باکتریها بررسی می شود.سوالاتی که باید پرسیده شوند عبارتند از: · آیا باکتریها گرم مثبتند یا گرم منفی؟ · شکل باکتری چگونه است؟ (باسیل،کوکسی،مارپیچ،چندشکلی،…) · آیا سلولها تک هستند یا زنجیره ای یا جفت؟ · سلولها چقدر بزرگ هستند؟ علاوه بر رنگ آمیزی گرم،رنگهای دیگری هم هستند که کاربرد کمتری دارند(مثلا” برای اسپور و کپسول). یک کلونی مشابه دیگر از پلیت اولیه جداشده و سپس از نظر خصوصیات بیوشیمیایی بررسی می شود،مثلا” آیا باکتری قندی مثل لاکتوز را تخمیر می کند یا نه؟در مواردی،باکتریها بوسیله آنتی بادی های تجاری ساخته شده ضد آنتی ژنهای سطحی خاص آنها شناسایی می شوند و روشهای مولکولی تجاری هم در حال حاضر به میزان وسیعی بکار می روند. تعیین خصوصیات تاکسونومیک باکتریها تنوع قابل توجهی حتی درون یک گونه وجود دارد.مقایسه گونه ها شامل مقایسه چندین سویه هر گونه است.مقایسه ها در ابتدا بر اساس تفاسیر شیمیایی و یا مولکولی می باشند. تفسیر شیمیایی ابزار پیچیده ای برای مطالعه محتوای ساختاری باکتریها موجود است(بیشتر در مورد اسیدهای چرب،کربوهیدراتها و یا یوبیکینون).مشخص کردن محصولات متابولیک ترشحی (مثل الکلهای فرار و اسیهای چرب با زنجیره کوتاه) نیز مفید است. تفسیر مولکولی مقایسه توالی کل DNA کروموزومی باکترها هم روش خوبی است ،اما در حال حاضر امکانپذیر نیست.میلیونها نوکلئوتید در هر سویه تعیین توالی شده اند.در چند سال اخیر،تعیین توالی کل ژنوم یک سویه به نمایندگی از گونه،در مورد تعداد کمی از باکتریها انجام شده است.در هر مورد،حجم کاری بسیار زیادی توسط گروههای تحقیقاتی جهت تعیین توالی انجام شده است.روش دیگر،بررسی تشابه ژنومی است که از گذشته بوسیله سنجش میزان محتوای گوانین (G) و سیتوزین (C) انجام می گرفته و به صورت درصد بیان می شود (% GC). دو روش دیگر،جایگزین این روش شده اند-هیبریدیزاسیون و تعیین توالی (بویژه ژن کد کننده 16S rRNA). تشابه DNA-DNA (و یا چگونگی کیفیت اتصال دو رشته DNA از باکتری مختلف به هم) برای مقایسه ارتباط ژنتیکی سویه ها یا گونه های باکتریها بکار می رود.اگر DNA از دو سویه مختلف باکتری،تشابه زیادی نشان بدهد(اتصال خوب آنها بهم)،سویه ها به عنوان اعضای یک گونه درنظر گرفته می شوند. DNA از گونه های مختلف باکتری(مگر اینکه خیلی بهم مرتبط باشند) همولوژی نشان نمی دهد. در سالهای اخیر،تعیین توالی مولکولهای 16SrRNA “بهترین استاندارد” در طبقه بندی باکتریها شده است.این مولکول،حدودا” هزار وششصد نوکلئوتید طول دارد.توالی این مولکول،ابزار مناسبی برای تعیین تشابه ژنومی در سطح بالاتر از گونه فراهم کرده که مقایسه تشابهات در میان کل باکتریها را ممکن می سازد. گونه های بسیار مرتبط با هم،اغلب توالی rRNA یکسانی دارند.بنابراین،این روش اطلاعات تکمیلی برای هیبریدیزاسیون DNA-DNA فراهم می کند. تعیین توالی ژنی 16S rRNA ودیگر نواحی ژنی،جهت شناسایی باکتریها در آزمایشگاه میکروبیولوژی بالینی بکار می رود. روشهای تشخیص سریع بدون کشت دادن قبلی پاتوژنهای خاص انسانی(از جمله عوامل بیماریهای سل،لایم و سیفلیس) را نمی توان در آزمایشگاه جدا کرد یا اینکه رشد بسیار کمی دارند.جداسازی موفق باکتری ممکن است به کندی صورت بگیرد و در مواردی غیرممکن باشد.جستجوی مستقیم باکتریها بدون کشت،در چند مورد غیرممکن است. یک روش ساده برای تشخیص سریع(به عنوان مثال،جسجوی آنتی ژن) در مطب بسیاری از پزشکان در مورد استرپتوکوکهای گروه A انجام می شود.از گلوی بیمار با سواب نمونه گیری شده و آنتی ژن استرپتوکوکی،مستقیما”از سواب جدا می شود(بدون کشت باکتریولوژیک قبلی) .آنتی ژن باکتریایی بوسیله تجمع(آگلوتیناسیون) ذرات لاتکس پوشیده شده با آنتی بادی جستجو می شود. توالیهای DNA باکتریایی را می توان مستقیما” از مایعات بدن انسان تکثیر داد(بوسیله PCR). در این حالت،مقادیر زیادی از ژنهای خاص و یا بخشهایی از ژنها تولید می شوند و سریعا” جستجو می شوند.برای مثال،موفقیت بزرگی در تشخیص سریع سل از این طریق حاصل شده.در نهایت،مشاهده مستقیم میکروسکوپی نمونه های بالینی برای بررسی حضور باکتریها نیز می تواند مفید باشد(مثلا” جستجوی M. tuberculosis در خلط). شناسایی سرولوژیک پاسخ آنتی بادی(در سرم بیمار) به عامل عفونی تنها می تواند در چند هفته بعد از شروع عفونت موفقیت آمیز باشد.